misa_primer3_pipeline

bioinformatics, genomics    

Misa鉴定SSR 并用primer3设计引物

Note: misa后续p3_in直接将fasta序列ID作为正则表达式,所以ID中尽量不要有"|*.?^"等奇怪符号,否则极有可能报错, 强烈建议跑之前替换掉奇怪字符

perl -pi.bak -ne 's/[^>0-9A-Za-z_]/#/g' XXXX.FASTA

for primer3 release 1.1.1:

  1. 用 misa 识别和定位SSR

MISA:含‘misa.pl’和‘misa.ini’

（注：‘misa.ini’为配置文件 用来设置识别SSR标记的标准。）

运行命令： 

perl misa.pl <**.fasta> 
#(misa.ini应与fasta文件放在同一目录下)

运行产生‘.misa’和‘.statistics’两个文件，‘**.misa’用于primer3引物设计。

  1. 用‘p3_in.pl’将输出文件‘.misa’转换成Primer3的输入文件

运行命令：

perl p3_in.pl **.misa
 #注：p3_in.pl程序会自动读取fasta源文件'**.fasta'，所以misa输出文件和源文件应与该程序在同一目录下。

运行产生‘**.p3in’，用于Primer3 输入。

3、用 Primer3 批量设计引物：

运行命令：

primer3_core.exe < **.p3in > **.p3out

4、用p3_out.pl解析 Primer3 输出文件：（要用到misa输出文件 **.misa）

运行命令：

perl p3_out.pl **.p3out **.misa

运行后得到 **.results 文件，制表符分割，可用Excel打开。

for primer3 2.3+:

其他不变 主要是p3_in.pl和p3_out.pl的改变,因为primer3 2.3以后 把输入和输出参数做了改动:

p3_in.pl改动(L30-33):

print OUT "SEQUENCE_ID=$id"."_$ssr_nr\nSEQUENCE_TEMPLATE=$seq\n"; print OUT "PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=100-280\n"; print OUT "SEQUENCE_TARGET=",$start-3,",",$size+6,"\n"; print OUT "PRIMER_MAX_END_STABILITY=250\n=\n";

p3_out.pl改动(L32-70):

/PRIMER_LEFT_0_SEQUENCE=(.*)/ || do {$count_failed++;print OUT "$misa\n"; next};
  my $info = "$1\t";
  
  /PRIMER_LEFT_0_TM=(.*)/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_LEFT_0=\d+,(\d+)/; $info .= "$1\t";
  
  /PRIMER_RIGHT_0_SEQUENCE=(.*)/;  $info .= "$1\t";
  /PRIMER_RIGHT_0_TM=(.*)/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_RIGHT_0=\d+,(\d+)/; $info .= "$1\t";
  
  /PRIMER_PAIR_0_PRODUCT_SIZE=(.*)/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_LEFT_0=(\d+),\d+/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_RIGHT_0=(\d+),\d+/; $info .= "$1\t";
   
  /PRIMER_LEFT_1_SEQUENCE=(.*)/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_LEFT_1_TM=(.*)/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_LEFT_1=\d+,(\d+)/; $info .= "$1\t";
    
  /PRIMER_RIGHT_1_SEQUENCE=(.*)/;  $info .= "$1\t";
  /PRIMER_RIGHT_1_TM=(.*)/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_RIGHT_1=\d+,(\d+)/; $info .= "$1\t";
  
  /PRIMER_PAIR_1_PRODUCT_SIZE=(.*)/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_LEFT_1=(\d+),\d+/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_RIGHT_1=(\d+),\d+/; $info .= "$1\t";
    
  /PRIMER_LEFT_2_SEQUENCE=(.*)/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_LEFT_2_TM=(.*)/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_LEFT_2=\d+,(\d+)/; $info .= "$1\t";
    
  /PRIMER_RIGHT_2_SEQUENCE=(.*)/;  $info .= "$1\t";
  /PRIMER_RIGHT_2_TM=(.*)/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_RIGHT_2=\d+,(\d+)/; $info .= "$1\t";
  
  /PRIMER_PAIR_2_PRODUCT_SIZE=(.*)/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_LEFT_2=(\d+),\d+/; $info .= "$1\t";
  /PRIMER_RIGHT_2=(\d+),\d+/; $info .= "$1";

安装Primer3后，发现直接使用命令

primer3_core <example >example.out

出现错误：

“PRIMER_ERROR=thermodynamic approach chosen, but path to thermodynamic parameters not specified”

  1. 一种解决办法是输入命令时加入-default_version=1的参数:

     primer3_core  -default_version=1  -output=example.out  example

  2. 另外一种解决办法如下：

创建文件夹（需要root权限）

mkdir /opt/primer3_config 然后将primer3-2.3.6/src/primer3_congfig/下的所有文件都移动创建的文件夹中 cp -R ./primer3_congfig/* /opt/primer3_config 重新使用命令就不会报错了 primer3_core <example >example.out